新型冠状病毒消失的中间宿主

SerendipityCamp
一年前  
229E,OC43,SARS,NL63,HKU1,MERS之后,SARS-CoV-2是已知感染人类的冠状病毒科的第七个成员,也是最神秘的一个狠角色。
但它绝不是最后一个。
“几千年来病毒一直生活在猪、蝙蝠、猴子体内,当人类摧毁了动物的家园,动物相继死去,他们就得换个宿主。”——《血疫》
当蝙蝠被我们妖魔化,却很少有人站在自然的角度审视这场“瘟疫”。
病毒学的研究使得人工干预自然,带来了人类进步,也带来了阴谋论。思考人类的所作所为的同时,我们也不免要思考病毒的自然起源,而这就是本篇写作的初衷。
在灾难面前,深度的反思就是在拯救我们人类自己。
1
来自马来的线索
文《「新型冠状病毒」消失的零号病人》里,关于病毒起源,我们留下了一个悬而未决的问题:
“为什么武汉新型冠状病毒和SARS病毒都恰好能作用于人类细胞表面的ACE2受体?它是怎样来到人间的?这些,都是科学家们正在追问的问题。”
恰好,就在两天前,著名病毒进化学家Kristian Andersen在virological上发表了个人观点,这一观点立即被其它著名病毒学家转载,这当中就包括哥大教授Vincent Racaniello,目前看来,这是当前最有技术含量的一篇阴谋论反驳性研究。
在这篇文章当中,Kristian提到了一个值得关注的细节,那就是关于病毒的动物宿主起源,初步分析表明,非法输入广东的马来穿山甲(Manis javanica)含有一种RBD结构高度类似SARS-CoV-2的冠状病毒。
除蛇,舟山蝙蝠,云南蝙蝠外,穿山甲也是一个值得怀疑的对象。
华南农业大学最早提出,穿山甲可能是新型冠状病毒的潜在中间宿主,但一直都没有令人信服的证据,直到以下两项研究浮出水面。
我们在前文提到过,决定病毒与ACE2结合最重要的部分,是RBD(受体结合结构域)的6个氨基酸残基。而研究者们惊奇的发现,在所有六个S1上关键RBD残基上,来自马来西亚的穿山甲完全与SARS-CoV-2病毒匹配——这个发现令人印象深刻。
SARS-CoV-2与ACE2受体结合相对应残基为L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。与SARS-CoV相比较,这六个残基中有五个在SARS-CoV-2中发生突变。尽管受体结合区的氨基酸突变来自人为的可能性几乎不存在,但这种不常见的高度结构相似性却令人印象深刻。
那么,这个发现又意味着什么呢?穿山甲真的是此次病毒爆发的罪魁祸首么?
在给出是或者不是的判断之前,我们似乎可以立即先给出一个显而易见的结论:
这个证据的存在显著降低了ACE2受体结合RBD关键点位来自病毒人工编辑的可能性——自然病毒的多样性让我们大开眼界,为什么要人工编辑呢?
继续观察,我们发现,以S蛋白中第486位残基为例,这里有一个苯丙氨F。
按照Kristian的说法:如果人为根据ACE2受体结合的几个关键残基,通过计算生物学进行人工设计的话,该点位上的苯丙氨酸并非是最优选择。同样的,其它关键点位上预测的最佳氨基酸残基也不是最优解。
在Kristian看来,这更像是自然选择的结果。
既然关键RBD受体结构域残基在自然界已经进行了“封装”,这就带来了新问题:
穿山甲与蝙蝠之间是否发生过基因重组呢?
如果认为穿山甲和蝙蝠之间发生过基因重组,重组的位置可能在哪里?
一个独立研究正好讨论了这个问题。研究发现穿山甲冠状病毒与SARS-CoV-2在S1-NTD亚区的序列相似性非常低,而在RBD和S2域的相似性显著增加。
这意味着,如果假设成立,重组最有可能发生在S1-NTD和RBD交界处。
但是,用这个发现来证明基因重组的真实存在却并不充分。原因如下:
我们在前文当中聊过,即使两个病毒分离株具有相同的氨基酸序列,也不能得出结论让其中一个病毒成为另一个病毒的来源。因为还存在隐性的核苷酸沉默突变,这种突变的积累,甚至可以让两种病毒的自然进化距离长达几十年之久。
虽然SARS-CoV-2与穿山甲冠状病毒在RBD氨基酸一致性水平很高,但在更深入的核苷酸水平上两者的同源性却并不高。如果存在上述蝙蝠和穿山甲的重组事件,这个突变事件很可能发生在遥远的过去,而不太像是最近几个月才发生的。
有研究人员通过对比现有数据库当中SARS-CoV-2的93个可用完整的基因组信息(来自GISAID 189和NCBI Genbank平台)发现,并不存在明显的核苷酸变异,这表明,在目前人体内取样的新型冠状病毒中,遗传变异是有限的。人类早期样本缺乏多样性——这个证据强烈的表明所有这些病毒都有一个相对较新的共同祖先。
然而,多个研究都倾向于认为,这个重组事件发生在几个月之前,而不是遥远的过去,所以,直接认定穿山甲是中间宿主的说法,从时间上来看并没有得到充分的支持。
尽管马来穿山甲相比RaTG13,部分地解释了ACE2受体突变的自然来源,但更完整的测序表明,马来穿山甲冠状病毒并不比云南蝙蝠RaTG13病毒更加接近SARS-CoV-2。而且,任意两者之间的自然进化距离也是显而易见的。
使用目前可用的基因组序列数据对SARS-CoV-2最新共同祖先(tMRCA)的时间估计指出,病毒最可能出现在12月初(置信区间为2019年10月底至12月中旬),这与最早的回顾性确诊病例相符。
而很多证据显示,在这个时间点之后,病毒几乎马上就具备了人传人的能力。我们仍不清楚关键突变是在那个环节发生的。
当然并非完全没有证据,比如回顾性血清学研究有可能提供给我们信息,而且事实上已经有人进行了一些这样的研究:
这项研究显示,动物贸易商人对SARS冠状病毒的血清阳性率为13%
这个研究发现,中国南部一个村庄的3%居民对这些病毒的血清阳性。
但有趣的是,武汉市200名居民没有出现冠状病毒血清反应性。(有人指出这个研究无法区分阳性的血清学反应是否是由以前感染过SARS-CoV或SARS-CoV-2引起的。应进行进一步的回顾性血清学研究以澄清这个问题。)
相互矛盾的证据明没有带给我们明确的答案。
最终,穿山甲带给我们的新证据并没有从根本上消除我们对病毒来源的质疑,但至少我们在自然界当中找到了蓝本。虽然新型冠状病毒的来源仍然扑朔迷离,但至少我们又稍稍远离了阴谋论一点。
2
氨基酸的舞蹈
前的的研究确定了,SARS-CoV-2基因组的两个显著的“异常”特征突变,这也是外界病毒人工合成阴谋论的两个支点:
1.根据结构模型和早期生化实验,SARS-CoV-2似乎被优化以结合人类ACE2受体。
2.SARS-CoV-2的高度可变的刺突S蛋白通过插入12个核苷酸(4个氨基酸)在S1和S2边界处带出一个多碱基(furin)裂解位点。这导致在多碱基裂解位点周围获得O-连接聚糖。
关于第一个问题,我们已经有所洞察,那我们又该如何理解第二点呢?
我们知道,冠状病毒基因组的后1/3很重要——包含了至关重要的编码结构蛋白。它们包括纤突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope,E)、囊膜蛋白(membrance,M)和核蛋白(nucleocapsid,N)。
其中,E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程,N蛋白包裹基因组形成核蛋白复合体,S蛋白则主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵。
而S蛋白的裂解活化对病毒入侵能力以及毒力起到了关键作用。
对于SARS-CoV来说,S蛋白的裂解需要与受体ACE2结合引起S蛋白构象改变后才能完成。
S1球状附着蛋白与S2纤维状融合/进入蛋白的排列是一种非常古老的分子机器。
S1/S2复合体的出现,可能要追溯到6500万年前发生的恐龙大灭绝事件时白垩纪/第三纪。病毒附着/融合机制可能起源于侏罗纪的某个病毒公园,从那时起在形式和功能上就一直保存下来。
为方便理解,可把S蛋白参与的膜融合过程分解成图 2所示的6个过程:首先,S蛋白“站在”病毒表面上,融合准备状态(A);随后,S蛋白受体结合域(Receptor binding domain)与细胞表面受体结合,在诱发作用下转换为发夹前体状态(Prehaipin intermediate),由非极性的融合肽(把那个三叉戟)嵌入细胞膜(B)
接下来融合过程中几个发夹前体在融合位点聚集(C),最后,融合蛋白折回,转变成紧密的杆状三聚体发夹(D-F),在融合蛋白折回过程中,细胞膜与病毒膜相互靠近,细胞膜开孔后,病毒遗传物质就可以进入细胞质开始复制。
善于折叠的S2是一种构象高度可变的蛋白质——在“变身”的同时仍然能够保持其螺旋结构。实际上,S2至少有三种不同的结构,而不是一种:
一开始看起来像一个大棚车,随后像“变形金刚”一样展开形成一个机器人,向上伸手抓住一个细胞膜,然后把它拉向自己脚下的病毒膜。随后立即弯腰,手指接触脚趾,把两层膜揉到一块,将它们融合在一起。以这种方式在细胞膜表面形成的孔允许病毒物质——包括RNA基因组,进入细胞内部并开始病毒复制。
关于S蛋白的裂解,大概分为两种情况,一种是病毒在组装过程中, S 蛋白在弗林蛋白酶(Furin)作用下 S1/S2 之间发生裂解,裂解过程发生于宿主细胞的高尔基体上;另一种是 S 蛋白在病毒侵染时发生裂解,即S蛋白在病毒组装过程中未发生裂解,其 S 蛋白的裂解和活化依赖于侵染过程中的蛋白酶类。
S蛋白在宿主细胞蛋白酶的作用下被裂解为S1和S2两部分,S1主要功能是与宿主细胞表面受体结合,S2亚基介导病毒-细胞以及细胞-细胞膜融合。
恰巧,在SARS-CoV-2,在典型的S1/S2交界处存在一个独特的强弗林蛋白酶易感位点——RRAR。Kristian认为,在S1/S2的交界区域突变出这样的位点可以增强细胞-细胞的融合,却并不影响病毒进入细胞。
据此有阴谋论者指出,这是人工编辑的证据之一,可事实是否如此呢?
在分析之前,我们先来谈谈:RRAR代表了什么?
实际上,R和A是两种不同的氨基酸,A代表丙氨酸,丙氨酸的体积很小,只包含一个带有三个原子的甲基,丙氨酸很普遍,你几乎可以在任何序列当中看到它。
而相对比较大的精氨酸R就比较重要了,其侧链以自由氨基结尾,给蛋白质链的一部分带来正电荷。由于细胞表面带负电,R具有天然细胞亲和力。重要的是,精氨酸R可以作为常见弗林蛋白酶分解的位点。
而RRAR这个不同寻常的序列足以作为SARS-CoV-2当中S蛋白的裂解位点(S1/S2将在此裂解),RRAR是SARS-CoV-2的一个独特特征,于是,精氨酸R在这个关键部位与病毒融合/进入蛋白成熟过程中起着关键作用。
也就是说,突变引入RRAR弗林蛋白酶切割基序可能是SARS-CoV-2能够在人类中复制的一个重要因素(另一个是介导ACE2结合的突变),需要得到足够的重视。
我们知道,不同种属冠状病毒S蛋白是否发生裂解以及裂解时间和裂解方式相差很大。独特的S1/S2裂解模式是SARS-CoV-2病毒在生物学上的显著差异。
正是由于裂解模式的不同,虽然ACE2同时是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体,但对SARS起作用的酶的活性位点不是SARS-CoV-2的S1与ACE2分子结合位点的一部分。因此,使用可用于控制血压的ACE2抑制剂来对付SARS-CoV-2冠状病毒(抑制S1的结合)的预期效果可以认为很低。
无独有偶,这里还有一个重要的发现:
除了两个碱性精氨酸(R)和一个在切割位点的丙氨酸外(A),RRAR之前,还插入一个脯氨酸(P);与近似冠状病毒比较,这个SARS-CoV-2特有的全新插入的序列其实是PRRA。
脯氨酸P的作用是,可以让主链原子被环化成环状结构。
由于脯氨酸的两端不是围绕每个主链键自由旋转,而是彼此锁定成130度角,因此脯氨酸在蛋白质链的关键部位产生扭结。
正是它的插入产生的转角结构,导致S673,T678,S686发生添加O-糖基化。
这又是什么意思?
我们知道,丝氨酸S和苏氨酸T都是羟基化氨基酸(-OH)。除了容易与水相互作用外,它们也可能将多糖化合物添加到蛋白质链中,即所谓的O-糖苷键,这意味着将糖衣覆盖到蛋白质该区域,从而屏蔽S蛋白上的潜在表位或关键残基。而Kristian也提到,关于这个结构的潜在功能我们还并不清楚。
如上图所示,资深微生物学和分子遗传学专家William R.Gallaher博士曾经提到,在S2的左侧,与S1的交界处附近描绘了一组黑色球。它们表明这一组S残基被认为是O-糖基化的可能位点,这将倾向于形成糖衣并保护S2蛋白的融合肽基序周围的区域。
之前的经验表明,糖基化是最丰富和最多类型的蛋白翻译后修饰。这种修饰形式能调节蛋白质的结构,稳定性和功能,并在大多数生物过程中起到广泛,且高度特异的作用。
而在14个氨基酸长度的一段短短的序列上,同时出现了两个精细的功能性结构突变:插入RRA带来的RRAR裂解点位,以及插入脯氨酸P引发的O-糖基化。是很难通过体外细胞培养来实现的——这至少降低了人工实验室培养病毒的可能性。
而且,突变带来O-糖基化,通常意味着免疫系统的参与,而这种免疫系统在体外细胞环境是不存在的。
同时,Kristian还认为,通过动物体内自然进化产生的可能性虽然很低,但也不是不可能。毕竟一些人类beta冠状病毒,比如HCoV-HKU1,都具有多碱基的裂解位点,以及在S1/S2裂解位点附近预测的的O-连接聚糖等特征。
大自然作为巨大的病毒库,为我们提供了先例。
穿山甲冠状病毒的研究发现,其中不包含弗林蛋白酶切割位点RRAR。
这也许意味着其他中间宿主存在的可能性——病毒可能在这些宿主上形成了弗林蛋白酶切割位点,之后传播给人。
如果这个假设成立,按照Kristian的看法,这种中间宿主体内的病毒进化为新型冠状病毒,需要具备两个前提条件:
此中间动物宿主具有极高的密度,这样自然选择突变才能迅速发生。
此中间宿主有与人类基因同源的ACE2基因。
当然,我们并没有排除中间宿主是Manis javanica马来穿山甲之外的其它种类的穿山甲的可能,只是因为我们缺少对其它种类穿山甲物种的信息采集。在穿山甲和其他可能携带SARS冠状病毒的动物身上进一步鉴定冠状病毒仍然是一项重要的任务。
如果病毒不是在中间宿主体内进化为新型冠状病毒的话,Kristian也提出了另一种可能:多碱基切割位点插入也可能发生在人与人之间的传播过程中。当然,需要特定的插入或重组事件才能使SARS-CoV-2作为一种流行性病原体出现。
按照这个思路推演,在人传人实现之前,早期人畜共患病期间的情况,基本上相当于阿拉伯半岛上MERS-CoV爆发的情况,在那里,所有的人类病例都是由于从骆驼身上的病毒对人产生单一感染或短链传播。经过8年对2499例病例的治疗,病毒还没有出现一种人传人的进化突变。
而我们唯独缺乏对这一阶段的早期发现。
最终,Kristian总结了他对于SARS-CoV-2起源看法的两个可能性:
1.在人畜共患传染病转移之前在非人类动物宿主中的自然选择
2.在人畜共患传染病转移之后在人类中的自然选择
如果是前者,SARS-CoV-2预先感染了另一种中间宿主,那么我们花费了巨大的代价控制了当前流行病的人-人传播,病毒也有可能在未来再次通过动物传播给人类。
如果是后者,如果我们所描述的突变过程发生在人类身上,那么即使我们重复了人畜共患病,除非重新发生相同的一系列突变,否则同样的病毒在将来也不太可能爆发。
以上的两种可能性,哪一个更可能发生?你又更希望哪一个会发生?
3
不可知的大自然
们来汇总一下已知的事实:
SARS-CoV-2可能在细胞培养的传代过程中获得RBD突变位点,这在以下的两项研究当中已经被证实。
关于多碱基裂解位点的研究显示,在低致病性禽流感病毒在细胞培养或动物中长时间传代后,也观察到新的多碱基裂解位点。比如鸡Newcastle病毒的一个无毒分离物在鸡的连续传代过程中,通过在其融合蛋白亚基的连接处逐渐获得一个多碱基裂解位点而变得高度致病。
但O-连接聚糖的获得(如果是功能性的)否定了前两点的可能性:O-连接聚糖的产生通常意味着免疫系统的参与,而这种免疫系统在体外细胞培养环境下是不存在的。
在前文当中,我们已经基本排除了病毒人工基因编辑的可能。
Kristian认为,SARS COV-2不可能通过现有的SARS相关冠状病毒的实验室操作而出现,遗传数据也显示,SARS-CoV-2并非来自任何先前使用的病毒主干。
再结合以上三点证据,似乎唯一比较可行的通过细胞培养或动物传代途径,人为有意识制造SARS-CoV-2的方法是:
事先分离具有高度遗传相似性的前体病毒。随后产生的多碱基裂解位点需要在细胞培养中或具有与人类相似的ACE-2受体的动物(如雪貂)中进行密集的传代。
当然,在证明或证实以上猜想之前,我们仍然没有排除故意泄露或无意泄露SARS-CoV-2的可能性(如果这种病毒真的能够按照这种方式被有意识地培养出来的话)。
为了最终确定病毒的来源,我们仍然需要更多法医学,分子病毒学,基因组学,流行病学的证据给出严肃和严密的证明,但识别零号病人和早起病例(包括与武汉海鲜市场无关的病例),或直接的动物源并从中获得病毒序列将是揭示病毒起源的最确定方法。
大自然制造病毒的想象力远远超越了人类有限的认知,那些诉诸阴谋论的人们,往往却忽视了自然的博大和神奇。
《湮灭》片中,文崔斯博士临死前说:
“它跟我们不一样,我不知道它想要什么,或者是它是不是想要。”
让人类恐惧的并不是病毒本身,而是大自然的无意识创造病毒的不可知的力量。
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